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深度解析脂質(zhì)納米粒(LNP)如何遞送RNA藥物

作者:英納氏            發(fā)布時間:2022-07-19

概要:脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)是一種具有均勻脂質(zhì)核的脂囊泡,被廣泛應(yīng)用于小分子藥物和核酸輸送,最近因為在COVID-19 mRNA疫苗遞送平臺取得的顯著成功引起了廣泛的關(guān)注。然而,mRNA誘導(dǎo)的短暫蛋白表達(dá)的應(yīng)用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領(lǐng)域,也為癌癥疫苗、蛋白質(zhì)替代療法和罕見遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而,未包覆的mRNA本身并不穩(wěn)定,很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經(jīng)LNPs包覆的mRNA可以免受細(xì)胞外核糖核酸酶的影響,并有助于細(xì)胞內(nèi)mRNA的遞送。在這篇文章中,我們將討論RNA遞送所使用LNPs的核心特征。本文將聚焦于mRNA遞送用LNPs;然而,也相應(yīng)地列舉了siRNA-LNP遞送的例子,以突出核酸結(jié)構(gòu)造成的共性和差異。首先,將介紹LNPs的概念,利用核酸作為治療藥物的優(yōu)點和缺點,以及LNPs分子構(gòu)成的一般推理;同時簡要介紹了臨床上基于LNPs的核酸治療的最新成功經(jīng)驗。其次,闡述了LNP自組裝的理論和方法。所有制備方法的共同理念是誘導(dǎo)核酸和帶電脂質(zhì)之間的靜電相互作用,并通過疏水作用促進(jìn)納米顆粒的生長。第三,根據(jù)基本性質(zhì)和用途對LNP進(jìn)行成分分解,包括公認(rèn)的分子設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)、商業(yè)來源,對細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊懀约皩NPs性能的貢獻(xiàn)。LNPs的關(guān)鍵成分之一是啟動與內(nèi)吞體膜的靜電結(jié)合、并促進(jìn)胞質(zhì)釋放的可電離脂質(zhì);然而,其他脂質(zhì)成分的作用也不應(yīng)忽視,因為它們與LNPs的穩(wěn)定性、間隙和分布密切相關(guān)。第四,從整體上回顧了對RNA遞送有重要影響的LNP結(jié)構(gòu)屬性,包括LNP的尺寸、電荷、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)封裝、脂膜水合作用、穩(wěn)定性和對生物大分子的親和性;還將討論這些屬性的檢測技術(shù)以及調(diào)控方法。最后,展望了RNA療法的未來,并提出了LNP配方和優(yōu)化領(lǐng)域中存在的一些問題。

 

1.引言

近年來,脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)顯示其在RNA疫苗和療法中作為遞送系統(tǒng)的的實用性。無包覆的RNA是一種帶負(fù)電荷的親水大分子,由于細(xì)胞膜的靜電排斥,很難進(jìn)入細(xì)胞,并被無所不在的核糖核酸酶(RNase)迅速降解。因此,它需要一個保護(hù)層以增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部機(jī)會。由于細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)構(gòu)成,因此,使用脂質(zhì)體包覆RNA可以使RNA更容易通過細(xì)胞膜并將其釋放到細(xì)胞質(zhì)中。為了實現(xiàn)這個目的,脂質(zhì)體首先需要一個帶正電的脂粒,可以附著在帶負(fù)電的RNA上。然而,由永久性陽離子脂粒組成的脂質(zhì)體會對帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電破壞從而引起細(xì)胞毒性。因此,脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步改進(jìn),通過酸性內(nèi)溶酶體途徑獲得正電荷;LNP成分也擴(kuò)展到了結(jié)構(gòu)脂類(模擬細(xì)胞膜并屏蔽正電荷)和聚(乙二醇)-錨定脂類(防止LNPs聚集以及與生物環(huán)境的副反應(yīng))。從FDA批準(zhǔn)了首個siRNA-LNP藥物(Onpattro)和mRNA-LNP新冠疫苗(Comirnaty)以及Moderna新冠疫苗的緊急使用授權(quán)(EUA)等這些該領(lǐng)域的主要監(jiān)管里程碑事件可以明顯看出,基于LNP的核酸遞送方法是安全的,適用于各種療法。然而,目前還沒有適合所有疾病的萬能方案,因此LNP的優(yōu)化工作依舊任重道遠(yuǎn)。本文將討論用于選擇RNA-LNP遞送脂類所需的主要科學(xué)和制造概念。

2.制備

LNP的制備依賴于自組裝能力,即脂質(zhì)成分在分子間相互作用的基礎(chǔ)上自發(fā)組裝成納米實體。LNP的形成從帶負(fù)電荷的核酸和帶正電荷的脂類之間的靜電結(jié)合開始。然后,LNPs通過疏水性和脂質(zhì)組分之間相互作用的范德華力增長。由于脂質(zhì)的多樣性、核酸的獨特性及兩者混合過程的瞬時性,對自組裝的早期階段及其對LNP最終性質(zhì)的相關(guān)影響的表征仍然極具挑戰(zhàn)。此外,LNP制造協(xié)議至少在兩個方面影響產(chǎn)品的自組裝: LNPs的均勻性和核酸負(fù)載效率。

LNP有多種制備方法,如脂膜泡擠出法、脂膜再水化、納米沉淀法和微流體混合法。然而,通常的制備方法是將水和脂質(zhì)組分快速混合。微流控技術(shù)以其良好的重復(fù)性而成為當(dāng)前臨床前研究的首選方法。新型微流控設(shè)備制造取得的進(jìn)展使這種方法更容易實現(xiàn),采用平行微流體通道或改進(jìn)的傳統(tǒng)方法(如移液管混合和t型混合器)等其他途徑也可以實現(xiàn)LNPs的高通量制備。一般來講,微流體混合有利于將親水性部分封裝到疏水的脂質(zhì)核心中,但這一過程并不能嚴(yán)格需要核酸的參與。Kulkarni等報道,只要脂質(zhì)核心形成,LNPs可以在T型混合器內(nèi)與siRNA完成組裝。總的來說,混合方式的特性可能會影響LNPs的組裝效率和內(nèi)部結(jié)構(gòu),而自組裝過程的動力學(xué)因數(shù)則會決定最終的納米結(jié)構(gòu)。

3.配方

3.1陽離子和可電離脂質(zhì)

陽離子脂質(zhì)(CLs)和可電離脂質(zhì)(ILs)通過靜電相互作用啟動自組裝的第一步。含有CLs的脂質(zhì)體仍被廣泛用于核酸遞送。然而,由于毒性問題和缺乏體內(nèi)療效,它們已被對pH敏感的ILs所取代。當(dāng)被配制成LNPs時,ILs被設(shè)計成在生理pH下顯示電中性,但在酸性核內(nèi)體內(nèi)則表現(xiàn)為帶正電荷。這種pH適應(yīng)的電離性使其功效提升同時毒性降低,從而更適合于核酸遞送。這些脂類通常占配方中總脂類的30-50%。許多研究致力于微調(diào)ILs的屬性,以進(jìn)一步提高效率,特別是在難以觸及的組織。CLs和ILs的整體結(jié)構(gòu)可以分為三個部分:(1)頭基、(2)連接體及(3)尾部(圖1)。

圖1 CLs和ILs結(jié)構(gòu)及組件(頭基、連接體及尾部)示意圖

頭基 ILs的頭基通常帶正電荷。頭基的大小和電荷密度對核酸包覆、LNP穩(wěn)定、與細(xì)胞膜相互作用以及促進(jìn)核內(nèi)體中的釋放有重要作用。ILs也可能有多個可電離的頭基,盡管通常情況下只有一個。典型的基包括胺(從一級到四級)、胍和雜環(huán)群 (見圖1)。臨床應(yīng)用的ILs(DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315;見圖2)包含具有pH適應(yīng)電離性的叔胺頭基。ALC-0315和SM-102頭基中也含有末端羥基,可以減少頭基的水合作用,并提高其與核酸的氫鍵作用,可能會提高轉(zhuǎn)染能力。

圖2 特定ILs結(jié)構(gòu)及cpKa和cLogP值

 

連接體 連接體通常連接頭基與尾部,也可能包含在尾部內(nèi)(SM-102和ALC-0315;見圖2)。連接體會影響LNPs的穩(wěn)定性、生物降解性、細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率。在CLs和ILs設(shè)計中使用的常用連接器如圖1所示。ILs可能包含一個或多個連接體;然而,為了便于合成,大多數(shù)ILs只含有一種類型的連接體。連接體可分為不可生物降解型(如醚類和氨基甲酸酯類)和可生物降解型(如酯類、酰胺類和硫醇類)。生物可降解連接體由于可在體內(nèi)被快速清除,通常被作為首選,以確保多次給藥并減少潛在的副作用。值得注意的是,DLin-MC3-DMA,ALC-0315和SM-102都含有酯類連接體。對于SM-102,酯基團(tuán)周圍的修飾被證實會影響LNPs的清除、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。

尾部 疏水性的尾部會影響pKa、親脂性、流動性和融合性,從而影響納米顆粒的形成和效力。通常,一個IL包含1到4個由8到20個碳原子組成的飽和或不飽和的疏水性尾部。不飽和程度已被證明通過調(diào)節(jié)膜不穩(wěn)定相關(guān)方面影響核酸的遞送。DLin-MC3-DMA有兩條亞油基尾部,而ALC-0315和SM-102包含兩個假定為錐形的分叉飽和尾部,有助于對核內(nèi)體膜的去穩(wěn)定作用和核酸在細(xì)胞溶質(zhì)的釋放。

ILs可以被看作是多組分分子,其中的每個部分都需要被精確設(shè)計,以便安全、高效地包覆和遞送核酸。從整體上理解ILs的特性也有助于設(shè)計下一代ILs。這些性質(zhì)之一是計算出的ILs的pKa(cpKa),可以很容易地在硅中確定。常見ILs的cpKa值在9到10.5之間(圖2)。最近的一項研究表明,cpKa極度接近IL的實際pKa. ILs的cpKa似乎影響相應(yīng)LNP配方的整體pKa,這樣當(dāng)IL 的cpKa大約是8.5−10.5時,LNP的pKa值約為6−7。IL的cpKa和LNP的pKa之間的差值似乎是固定的,約等于2 - 4個單位。因此,cpKa可以作為新ILs產(chǎn)品設(shè)計的指導(dǎo)工具。ILs的另外兩個不太被關(guān)注的性質(zhì)是cLogP和cLogD值,它們分別代表分子在非電離態(tài)和電離態(tài)下的親油性。在最近的一項研究中,Rajappan等考察了pKa、cpKa和cLogD對LNPs遞送siRNA的影響,發(fā)現(xiàn)cLogD在10 - 14范圍內(nèi)的脂質(zhì)效果最好。因為一些常見的ILs的cLogP值在15−20范圍內(nèi) (圖2),在設(shè)計下一代ILs時也應(yīng)考慮其親油性性。由于電離度(cpKa)和親油性(cLogP) IL可以影響從最初的與核酸形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)到最終納米粒子形成以及核酸遞送的整個流程,在合成IL前同時考慮這兩個參數(shù)可能會極大的推動高效IL的發(fā)現(xiàn)。不過,需要更多的研究來印證這一觀點。

除了傳統(tǒng)的CLs和ILs外,還有一些兩性離子脂類的例子。在最近的一項研究中,Liu等人合成了一個名為iPhos的超過500種兩性離子脂質(zhì)的庫。這些iPhos由一個胺基、短疏水性尾部和一個磷酸鹽連接體組成。研究認(rèn)為,帶負(fù)電荷的磷酸基促進(jìn)了膜融合,并導(dǎo)致核內(nèi)體釋放。最優(yōu)的9A1P9的各種配方可以優(yōu)先將目標(biāo)核酸輸送到肝臟和肺部。

綜上所述,ILs各部分的性質(zhì)影響整體配方和生物學(xué)特性。過去50年間,為設(shè)計出理想的IL已經(jīng)有了許多系統(tǒng)的研究。其中一些ILs已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于基因制劑的遞送。然而,設(shè)計能夠在非肝靶上高效無毒地輸送不同類型的基因制劑的ILs仍需大量研究。對ILs合成有更多興趣的讀者可以參考一篇優(yōu)秀的相關(guān)綜述。

 

3.2固醇類

圖3 LNP配方中使用的固醇(綠色)、磷脂(藍(lán)色)和PEG脂質(zhì) (紅色)舉例

3.3磷脂類

磷脂有助于核酸的封裝和LNPs穩(wěn)定性的提高。與其他脂類成分相比,它們的研究相對較少,通常只占配方中總脂類的10 - 20%。磷脂因為可以自發(fā)地組織成脂質(zhì)雙分子層,并且具有較高的相變溫度從而確保LNPs的膜穩(wěn)定性而被用作結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。磷脂位于LNPs的外圍,就像細(xì)胞膜一樣。這些脂類通常是半合成的,例如,磷脂酰膽堿通常來自蛋黃和大豆等天然來源,可以通過化學(xué)修飾使其包含脂肪酸尾部。二硬脂酰磷脂酰膽堿 (DSPC)(見圖3)是一種臨床批準(zhǔn)的LNPs結(jié)構(gòu)脂質(zhì),用于如siRNA治療(Onpattro)和針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗。DSPC在結(jié)構(gòu)上由磷脂酰膽堿頭基和兩個飽和18碳尾組成,形成一個緊密堆積的脂質(zhì)雙分子層。在LNPs中,它主要位于納米顆粒表面,同時在納米顆粒核中少量存在。二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是另一種經(jīng)常用于LNPs臨床前研究的磷脂。由于尾部不飽和,DOPE不僅形成流動性更好的脂質(zhì)層,而且具有形成六邊形II (HII)相結(jié)構(gòu)的內(nèi)在能力。HII相結(jié)構(gòu)被認(rèn)為能促進(jìn)脂質(zhì)膜與核內(nèi)體膜的膜融合,進(jìn)而使核酸制劑在胞質(zhì)內(nèi)釋放。多項研究表明,與DSPC相比,DOPE可以提高率磷脂基LNPs中RNA的轉(zhuǎn)染效率。近期,Zhang等人報道稱,DOPE可導(dǎo)致C12-200 LNPs在肝臟內(nèi)的聚集,而DSPC會導(dǎo)致靜脈給藥時脾積聚,證明了結(jié)構(gòu)脂質(zhì)對LNP生物分布的影響。我們還發(fā)現(xiàn),用天然糖脂替代MC3基LNPs中的DSPC會影響mRNA轉(zhuǎn)染,來自植物的膜脂--高絲氨酸(DGTS)(見圖3),可以根據(jù)給藥途徑表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效率。總之,這些研究突出了結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在LNPs介導(dǎo)的RNA遞送中的重要性。

3.4嵌PEG脂質(zhì)

嵌PEG脂質(zhì)(PEG-lipids,見圖3)是控制LNPs半衰期和細(xì)胞攝入的一個重要組成部分。在LNP組裝過程中,PEG鏈由于其親水性和大體積而位于納米顆粒的外殼中。與其他納米載體一樣,PEG為LNPs提供了外部聚合物層,以阻礙血清蛋白和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吸附,延長體內(nèi)循環(huán)時間。PEG還可以防止納米顆粒在儲存過程以及血液中的聚集。此外,PEG脂質(zhì)的含量可能決定顆粒的大小。PEG脂質(zhì)的另一個潛在用途是功能化LNP的表面,使LNPs與配體或生物大分子結(jié)合成為可能。例如,Singh等使用DSPE-PEG-胺通過NHS/EDC化學(xué)共軛結(jié)合透明質(zhì)酸來靶向治療腫瘤,Parhiz等使用DSPE-PEG-馬來酰亞胺通過SATA-馬來酰亞胺化學(xué)共軛結(jié)合抗體。雖然PEG有助于LNP的穩(wěn)定性和生物偶聯(lián),但其解吸對細(xì)胞轉(zhuǎn)染也至關(guān)重要。PEG從LNPs中的脫落可使血清蛋白(如載脂蛋白和白蛋白)產(chǎn)生調(diào)理作用,這是LNPs發(fā)生受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用的關(guān)鍵效應(yīng)物。Akinc等人證明ApoE與LNPs結(jié)合后,導(dǎo)致低密度脂蛋白受體(LDLR)介導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)化。由于PEG脂質(zhì)抑制ApoE與LNPs的結(jié)合,過量的PEG 脂質(zhì)會對LNPs的細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)染產(chǎn)生不利影響。含有較少PEG脂質(zhì)的LNPs由于更容易與ApoE結(jié)合表現(xiàn)出更高的酸遞送效率。PEG脂類脂質(zhì)錨的長度也是決定解吸速率的重要因素。Mui等報道了PEG從LNP的脫落與PEG-脂質(zhì)錨定長度成反比,這是因為PEG-脂質(zhì)與LNP膜之間的疏水相互作用隨著PEG-脂質(zhì)錨定長度的增加而增加。Suzuki等提出,PEG脫落的速度也可能影響抗-PEG抗體的產(chǎn)生,并反復(fù)給藥會引起并發(fā)癥。靜脈給藥LNP配方中PEG脂質(zhì)的含量很少超過2%;然而,密集的聚乙二醇層可能有利于達(dá)到肝外靶點。Lee等的研究結(jié)果顯示,相較2.5%的PEG脂質(zhì)含量,5%的PEG脂質(zhì)含量時LNPs在腫瘤中的積累更量高于,Lokugamage等的研究表明,PEG脂質(zhì)對霧化LNPs的遞送至關(guān)重要。因此,LNPs中PEG脂質(zhì)的含量和種類可能需要根據(jù)臨床需求謹(jǐn)慎調(diào)整。

4.性質(zhì)

LNPs的平均尺寸和尺寸分布是各種應(yīng)用中LNP質(zhì)量和適用性的重要初始決定因素,這些性質(zhì)通常用動態(tài)光散射(DLS)來研究。一般來說,LNP的最佳尺寸為20 - 200nm,因為這個尺寸使其在流體(如血液和淋巴)中足夠穩(wěn)定,同時能夠穿過間隙。LNP的尺寸通常通過改變PEG脂質(zhì)的量或混合參數(shù)(如流速和體積比)來調(diào)節(jié)。LNPs的尺寸可能會影響其內(nèi)吞、生物分布、降解和清除,不同的應(yīng)用可能需要不同的粒徑。例如,45 nm的siRNA LNPs在皮下給藥時最有效,而80 nm 的siRNA LNPs在小鼠靜脈給藥時最有效。然而,對嚙齒動物和非人靈長類動物中各種粒徑mRNA-LNP的對比表明,非人靈長類動物肌肉注射時對LNPs粒徑不太敏感。

LNP依靠表面電荷與細(xì)胞膜和生物環(huán)境進(jìn)行相互作用。由于細(xì)胞膜帶負(fù)電荷,表面帶負(fù)電荷的LNPs會被細(xì)胞膜排斥從而不被細(xì)胞吸收。另一方面,帶正電荷LNPs可能會直接破壞細(xì)胞膜,引起細(xì)胞毒性。這就凸顯了可電離脂質(zhì)在LNP設(shè)計中的重要性:最初,含有可電離脂質(zhì)的LNP是中性的,可以避免任何不必要的靜電相互作用,但在酸性內(nèi)體pH環(huán)境下會帶正電荷。LNPs的表面電荷通常用zeta電位測量來評估,該技術(shù)通常用于評估膠體聚集,盡管沒有嚴(yán)格的分類,但如果zeta電位落在-20和+20 mV之間,則認(rèn)為表面電荷較弱。調(diào)整LNPs總表面電荷的一種常見方法是調(diào)整N/P比或者說電離脂質(zhì)(N代表陽離子胺)與核酸(P代表陰離子磷酸鹽)的比值。Carrasco等認(rèn)為,增加含有可電離脂質(zhì)KC2的LNPs中的N/P比可以增加表面電荷和封裝效率。有趣的是,在LNPs中加入永久帶電的脂質(zhì)時可能在不增加表面電荷的情況下改變優(yōu)先攝取的器官。Cheng等基于脂質(zhì)電荷在小鼠中實現(xiàn)了選擇性器官靶向(SORT):向LNP配方中添加帶正電荷的脂質(zhì)可實現(xiàn)肺組織的優(yōu)先轉(zhuǎn)染,而帶負(fù)電荷的脂質(zhì)則將轉(zhuǎn)染導(dǎo)向脾臟。

脂質(zhì)封包可能會影響從膜的水化和變形能力到細(xì)胞攝取和核酸釋放等許多參數(shù)。最近的一篇綜述總結(jié)了形成脂質(zhì)囊泡所需的脂質(zhì)體的基礎(chǔ)知識。簡單地說,每種脂質(zhì)都可以用一個封包參數(shù)來描述,該參數(shù)取決于脂質(zhì)極性“頭”和非極性“尾”所占的體積。結(jié)構(gòu)平衡的脂質(zhì)形成柱狀結(jié)構(gòu)和層狀相,而“不平衡”結(jié)構(gòu)則形成六方、立方和膠束相。倒置的六方相(HII)表現(xiàn)出最顯著的脂膜融合促進(jìn)作用。到目前為止,非層狀相的可控制備在RNA-LNP遞送領(lǐng)域仍然是相對少見的,納米立方液晶是最突出的例子。然而,LNPs在暴露于環(huán)境誘因時可能發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。Heyes等利用核磁共振波譜(P NMR)研究了含有一系列具有不同脂尾的陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒的相變行為,發(fā)現(xiàn)層狀到倒置六方相轉(zhuǎn)變溫度(TBH)較低的脂質(zhì)具有更好的融合促進(jìn)能力,這一點在基因沉默效率上得到了證明。同樣,其中一個膜不穩(wěn)定理論提出,當(dāng)可電離脂質(zhì)暴露于晚期核內(nèi)體的酸性pH時,可電離脂質(zhì)與核內(nèi)體膜內(nèi)磷脂之間的靜電相互作用會導(dǎo)致膜破裂。Liu等最近的一項工作基于這一概念,報道了利用核磁共振波譜得到的一種新型可電離脂質(zhì)暴露于核內(nèi)體模擬物時倒置六方相形成的證據(jù)。雖然pH誘導(dǎo)關(guān)聯(lián)是脂質(zhì)材料最常見的機(jī)制,但在我們最近的綜述中討論了其他導(dǎo)致核內(nèi)體膜不穩(wěn)定的路徑。

由于脂質(zhì)相和整體極性的不同,脂膜可能會捕獲水從而改變膜的流動性或變形性,這可能會影響脂膜融合。膜水合作用也可能影響對pH的潛在響應(yīng),而pH通常作為啟動核酸釋放的一個重要環(huán)境誘因。LNP在其生命周期中所涉及的pH波動如圖4所示。當(dāng)LNPs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間時,它們被束縛在核內(nèi)體中,而核內(nèi)體在成熟為溶酶體時會逐漸酸化。因此,脂質(zhì)膜內(nèi)較高的含水量可能會影響酸化動力學(xué),并有加速膜的失穩(wěn)。Koitabashi等通過Laurdan實驗研究了siRNA-LNPs中pH值對脂膜穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)膜水合作用與基因沉默效率呈正相關(guān);然而,該研究并未關(guān)注酸化動力學(xué)。關(guān)于膜水合有一個有意思的現(xiàn)象,核磁共振波譜結(jié)果表明,siRNA-LNPs比相同配方的mRNA-LNPs的含水量更少,這可能是因為親水RNA鏈的長度更長。Carrasco等進(jìn)一步證明了這些觀點,他們發(fā)現(xiàn)低N/P比的KC2 LNPs單個納米顆粒中包含更多的mRNA和脂質(zhì),并且有較高的介電常數(shù),認(rèn)為低N/P比的LNPs比高N/P比的LNPs更易水合。更高的RNA載量也會使轉(zhuǎn)染得到改善。因此,mRNA-LNPs可能對環(huán)境變化更敏感,盡管pH敏感性的變化可能與生物過程的時間尺度無關(guān)。暴露在生物環(huán)境中的重組進(jìn)一步使LNP殼水化的問題變得復(fù)雜。

圖4 LNP生命周期中涉及的pH變化

LNPs固有的水環(huán)境也對其長期穩(wěn)定構(gòu)成威脅。純核酸在環(huán)境條件下可通過外源RNase降解或自水解迅速惡化。雖然LNPs可以保護(hù)核酸免受酶降解,但它們?nèi)菀滓驗闊崃W(xué)因素(如最小化相分離)聚集,可能導(dǎo)致納米顆粒融合時核酸的丟失,最終影響轉(zhuǎn)染效率。低溫保存和凍干可以保護(hù)RNA,但是冰結(jié)晶會損傷LNPs,盡管加入蔗糖等低溫保護(hù)劑似乎可以緩解這個問題。有趣的是,LNPs可能會根據(jù)儲存條件改變優(yōu)先攝取其的器官,這可能是它們重組的結(jié)果。從實踐的角度來看,最近開發(fā)的針對COVID-19的mRNA-LNP疫苗為RNA療法創(chuàng)建了物流基礎(chǔ)設(shè)施,這可能會消除關(guān)于LNP穩(wěn)定性、存儲和運(yùn)輸?shù)脑S多擔(dān)憂。這些疫苗擁有在冷凍溫度(-20°C)下長達(dá)6個月的以及室溫下長達(dá)30天的長期穩(wěn)定性,極大地推動了這些突破性治療的普及。值得注意的是,輝瑞/BioNTech和Moderna疫苗有著不同的存儲要求,這表明LNP配方的變化可能會顯著改變其核酸親和力和LNP穩(wěn)定性。由于目前還沒有建立針對這些非晶材料的加速穩(wěn)定性測試的方法,這意味著,LNP穩(wěn)定性只能在離散時間點進(jìn)行經(jīng)驗評估,差示掃描量熱法(DSC)等方法可能對LNP退化提供有價值的參考。最后,預(yù)測基于LNP的RNA療法的下游特性需要我們對LNP的自組裝過程有更深的理解。

圖5 LNP結(jié)構(gòu)待解決問題

5.結(jié)論和展望

LNPs是一種高度可定制的核酸載體,在mRNA疫苗中顯示出巨大的潛力。我們也不應(yīng)忽視它們在治療罕見疾病和癌癥方面的可能價值。mRNA治療可以幫助產(chǎn)生治療性蛋白來恢復(fù)受損組織或器官的功能。全球開展了大量的科學(xué)研究來設(shè)計和細(xì)化LNPs的單個成分,以便高效和安全地遞送所關(guān)注的核酸。然而,LNP科學(xué)方興未艾,還有許多懸而未決的問題,圖5中列出了其中的一些。毫無疑問,公眾對mRNA疫苗的持續(xù)高漲的興趣將激勵這一領(lǐng)域的研究工作,我們謹(jǐn)慎樂觀地認(rèn)為,我們正在見證納米醫(yī)學(xué)的新時代。

原文來源:Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.


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